绿脓杆菌，是引起水貂出血性肺炎的主要病原菌。该病多发于温暖潮湿的夏秋两季，发病急，死亡快，病死水貂肺部呈现出严重的病理变化。此病的死亡率非常高，目前已成为严重阻碍我国水貂养殖业发展的烈性传染病之一。此外，绿脓杆菌还能感染狐狸、雏鸡、羊、兔等动物以及引起人的外伤、烧伤、尿道感染，是危害极其严重的人畜共患病。本研究从临床病死水貂中分离鉴定得到一株绿脓杆菌,并对其进行了耐药性分析，为地区性水貂出血性肺炎的防治提供理论依据。
1.材料与方法
1.1病料
采自山东诸城某一水貂养殖场暴发的水貂出血性肺炎的病例
1.2 细菌分离纯化
无菌条件下对病死水貂肺脏划线，接种于血清营养琼脂平板中，置于37℃恒温培养箱中培养，长出单菌落后挑取菌落进行纯培养。
1.3 分离株的生理生化鉴定
参照中华人民共和国国家标准GB 7918.4-87《化妆品微生物标准检验方法》，对分离纯化的疑似菌株进行生化鉴定，包括十六烷三甲基溴化铵琼脂培养试验、染色镜检、氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验、42℃生长试验。
1.4 分离株的分子生物学鉴定
参考Genbank中公布的绿脓杆菌16S rRNA基因序列，利用Primer5.0 软件设计一对引物。上游：5’-ACGGGTGAGTAATGCC-3’，下游：5’-CAGTCTCCTTAGAGTGCC-3’，扩增片段长度为1051bp。PCR 采用25µl体系，取1.5µl样品作为模板，加入10×Ex Taq Buffer 2.5µl，上、下游引物各0.2µl，dNTP2µl、最后加Ex Taq酶0.2µl，用灭菌纯水补足到25µl。扩增条件为：94℃ 4 min；94℃ 30 s、55℃ 30s、72℃ 1min，30次循环；72℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.5 分离株的药敏试验
从固体培养基上挑取单菌落，均匀密集划线接种于血清营养琼脂培养基，按K-B纸片法测定该菌其对常用抗菌药物的敏感性。
2.结果
2.1细菌分离和培养特性 分离的细菌在血清肉汤培养基上形成圆形，光滑，稍隆起，边缘整齐或者波浪状的绿色菌落，并有独特的芳香气味（图1 A）。革兰氏染色镜检，为革兰氏阴性小杆菌，单个散在或成对出现（图1 B）。
图1 分离株形态学观察
A：固体培养基上的形态；B：革兰氏染色形态
2.2分离株的生理生化鉴定
分离菌生化试验结果如表1所示。分离株氧化酶试验、绿脓菌素试验、明胶液化、硝酸盐还原产气试验和42℃生长试验三者均为阳性，符合绿脓杆菌生化特性。
表1分离株的生化试验结果
|
试验项目
|
溴烷铵
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42℃生长
|
绿脓菌素
|
氧化酶
|
明胶液化
|
硝酸盐还原
|
|
分离株
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+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
2.3分离株的分子生物学鉴定
经过绿脓杆菌16S rRNA 保守序列PCR检测，该菌株在1051bp左右处产生目的条带，确定为绿脓杆菌菌株（图2）。
图2 绿脓杆菌16S rRNA鉴定结果
M：DL2000Marker；1：大肠杆菌阴性对照；2：分离株；3：阳性对照菌株
2.4分离株的药敏试验
通过对抑菌圈的大小进行测量比对，结果表明该细菌对丁胺卡那霉素、头孢哌酮-舒巴坦、庆大霉素高度敏感，对多粘菌素B、恩诺沙星、头孢曲松、链霉素中度敏感，对复方新诺明、阿莫西林、林可霉素耐药（表2）。
表2 分离株的药敏试验结果
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药物名称
|
判定标准
|
试验结果
|
敏感性
|
|
耐药
|
中敏
|
高敏
|
抑菌圈直径
|
|
丁胺卡那霉素
|
≥10
|
11-15
|
≤16
|
23
|
高敏
|
|
多粘菌素B
|
≥10
|
11-15
|
≤16
|
12
|
中敏
|
|
复方新诺明
|
≥10
|
11-15
|
≤16
|
0
|
耐药
|
|
恩诺沙星
|
≥16
|
16-22
|
≤23
|
20
|
中敏
|
|
头孢曲松
|
≥13
|
14-20
|
≤21
|
19
|
中敏
|
|
阿莫西林
|
≥10
|
11-15
|
≤16
|
0
|
耐药
|
|
林可霉素
|
≥14
|
15-18
|
≤19
|
0
|
耐药
|
|
头孢哌酮-舒巴坦
|
≥15
|
16-20
|
≤21
|
24
|
高敏
|
|
庆大霉素
|
≥12
|
13-14
|
≤15
|
18
|
高敏
|
|
链霉素
|
≥11
|
12-14
|
≤15
|
13
|
中敏
|
3.讨论
本试验从患出血性肺炎的病死水貂肺脏中分离致病菌，经过细菌形态学观察、生化实验、PCR鉴定，最终确定为绿脓杆菌。
不同地区分离的绿脓杆菌会因为血清型的不同或者当地的用药情况不同而对抗生素的耐药性产生差异，因此在实践中单一的特效药物是没有的，要根据药敏试验结果选择合适的药物进行治疗。根据本试验结果可以选择庆大霉素、头孢哌酮-舒巴坦或丁胺卡那霉素作为绿脓杆菌敏感抗菌药物。
近几年来，我国水貂养殖业发展较快，养殖数量及密度不断提高，但是环境管理和疾病控制却相对滞后。水貂在免疫力低下的情况下很容易感染一些条件致病菌，因此控制该类疾病除确定病原、接种疫苗、筛选敏感药物外，还需要提高水貂养殖环境，注重饲料的合理搭配，提高水貂免疫力，从而控制原发疾病，形成科学规范的饲养管理。
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